男性不育症患者精浆piR-32678 的表达及其临床意义

吴彤华1，2，3，陈春媚1，李红燕1，陈燕菲1，宋明哲1，叶丽君1，曾勇1，2，3
1. 深圳中山泌尿外科医院，广东 深圳 518045；
2. 深圳中山生殖与遗传研究所，广东 深圳 518045；
3. 深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，广东 深圳 518045

基金项目： 深圳市基础研究项目（JCYJ20210324121807021）；科技部课题（2018YFC1003904）。
第一作者： 吴彤华，女，硕士，主任技师，主要研究方向：分子诊断、生殖遗传研究。E-mail：anastasia_wu@sina.com。
通讯作者： 曾勇，男，本科，副主任医师，主要研究方向：生殖医学。E-mail：zengyong1966@sina.com。

不孕不育已成为全球关注的生殖健康问题。据中国人口协会2012年公布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，我国不孕不育率高达12.5%～15%。男性不育约占不孕不育的50%，精子发生障碍为主要病因，目前半数以上的生精障碍原因不明[1]。非编码的小分子RNA（non-coding small RNA,ncRNA），特别是微小RNA（microRNA,miRNA）和piRNA（piwi-interactingRNA），参与精子形成阶段的基因表达调节，其异常表达可能导致男性不育[2，3]。

miRNA在精浆中稳定存在，且不育症、少精子症、弱精子症、畸形精子症或非梗阻性无精子症人群的精浆miRNA表达谱，与正常健康男性间存在显著差异[3-5]。miRNA在各种组织中几乎都表达；而piRNA有显著的细胞特异性，主要在生殖细胞中大量表达。piRNA较miRNA能更好地反映生殖系统，生精障碍患者精浆中piRNA的差异表达可能有助于临床诊断。因此，本研究对无精子症及正常精液的精浆标本进行芯片检测，筛选差异表达的piRNA，并通过实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）验证，为临床诊治提供一种新的无创的分子标志物，亦为精子发生障碍的分子机制研究奠定基础。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2018年1月至4月深圳中山泌尿外科医院生殖中心就诊的男性不育症患者41例为研究对象，年龄35（25～54）岁。所有患者均为婚后夫妻性生活正常，1年以上未避孕未怀孕。依照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版的诊断标准，无精子症为精液标本经3000g离心15min后沉淀镜检无精子≥2次；少精子症为精子浓度＜15×106/mL。收集同期因女方因素不孕前来我院进行生育力评估的健康男性31例为正常对照组，年龄36（26～65）岁。其精液常规分析各项指标均在正常范围内。本研究经医院伦理委员会批准且患者知情同意。所有研究对象及正常对照外周血核型分析结果均未见异常，无精子症及少精子症患者Y染色体微缺失基因诊断未见缺失。

1.2 仪器与试剂

计算机辅助精液分析系统（西班牙SCA）、冷冻离心机（德国Eppendorf）、Bio Spec-nano紫外分光光度计（日本岛津）、Veriti梯度PCR仪（美国Lifetechnologies）、7500荧光定量PCR仪（美国Life technologies）。miRNeasySerum/PlasmaKit（德国Qiagen）、FSQ-101ReverTraAceqPCRRTKit（日本东洋纺）、SYBR Select Master Mix（美国Life technologies）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 

所有患者禁欲2～7天，用手淫法留取全部精液于清洁广口无毒的塑料容器内。标本置于37℃孵育，待充分液化后通过计算机辅助精液分析系统进行精液常规检查。精液在取样2h内，常温1500g离心5min，分离精子和精浆。吸取上清至新的Eppendorf管，4℃12000g离心5min，去除细胞及碎片，吸取上清精浆至新的Eppendorf管并-80℃冻存备用。

1.3.2 精浆piRNA芯片检测

随机选择5例正常对照与5例非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia，NOA）精浆标本，委托上海康成生物工程有限公司，提取RNA并使用ArrayStar公司的人类piRNA芯片进行检测，初筛两组间差异表达的piRNAs。

1.3.3 精浆RNA提取

-80℃冻存的精浆样本，于37℃水浴复融。吸取200μl精浆样本，采用miRNeasy Serum/Plasma Kit，按试剂盒说明书操作，最后以28μl无核糖核酸酶水洗脱，收集RNA。外参cel-miR-39-3p购自广州锐博生物技术有限公司，按说明书溶解及配制200nM工作液，分装，-20℃保存。每例样本提取时加入200nM的外参5μl。测定RNA的纯度和浓度。

1.3.4 逆转录（reverse transcription，RT）及实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR） 

外参cel-miR-39-3p的茎环法RT及qPCR引物购自广州锐博生物技术有限公司。piR-32678（DQ582566）的茎环法RT及qPCR引物设计通过sRNAPrimerDB在线引物设计软件完成（引物），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。取2μl总RNA，采用FSQ-101ReverTra Ace qPCR RT Kit进行RT，具体操作见说明书。无核糖核酸酶水10倍稀释cDNA产物。qPCR采用SYBR Select Master Mix，按说明书操作，在7500荧光定量PCR仪进行扩增。根据熔解曲线和扩增曲线判断扩增是否特异及有效。每个样本目的基因和外参基因均检测三个复孔。以2-△△Ct分析piR-32678的相对表达量。

 

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