男性不育症患者精浆piR-32678 的表达及其临床意义

3 讨论 

piRNA是一类大小为24～31nt的ncRNA，于2006年在雄性小鼠睾丸中被首次发现[6]。它与Argonaute蛋白家族中的PIWI蛋白特异性结合，形成piRNA沉默复合体。该通路在调控精子的发生和发育中发挥重要作用，主要包括：（1）抑制转座子；（2）介导泛素化降解；（3）调控mRNA的表达；（4）基因甲基化修饰；（5）染色质重塑[7]。当piRNA在数量、功能及调控上出现异常时，则可能会导致男性不育。因此，寻找男性不育人群差异表达的piRNA，为男性不育的病因诊断及评估男性不育合适的治疗方式提供新的分子标记物，具有重要的临床应用价值和意义。piRNA大量地、特异地在粗线期精母细胞和圆形精子细胞中表达，但睾丸活检为有创手术，故临床上对男性不育人群进行睾丸组织piRNA检测的可行性较低。已有研究证实，精浆中含有大量外泌体，且piRNA主要以外泌体形式，亦有部分以游离的形式稳定地存在于精浆中[8]。这说明精浆piRNA检测有望成为评价男性生育力的特异性非侵入性的新方法。

目前关于精浆piRNA与男性生育力评估的研究报道很少。Hong等选取17例正常健康对照、24例少精子症和21例无精子症患者的精浆分别进行混合，从三组混合精浆样本中提取RNA，对精浆中非编码小RNA进行高通量测序，初筛三组差异表达的精浆piRNA[9]。考虑到混合标本易因个别差异而有误差，故本研究选取正常对照及NOA各5例精浆标本，分别进行piRNA芯片检测，更能反映真实结果。芯片结果提示，NOA患者呈现异常的精浆piRNA表达谱。本研究选用的piRNA芯片涵盖Hong等研究中报道的5个显著下调piRNA中的两个（piR-43771和piR-43773）。芯片结果显示，与正常对照相比，NOA患者精浆piR-43771和piR-43773分别下调2.88倍和2.29倍，与Hong等研究报道的下调4.78倍和3.44倍结果相近。此外，有研究报道精浆piRNA-013423和piRNA-023386的水平与精子DNA完整性有关，DFI≥30%的患者这两个piRNA的表达均较DFI≤15%及15%＜DFI＜30%的患者显著下降，推测PIWI/piRNA通路异常可能导致人精子DNA损伤[10]。

既往关于男性不育患者精浆piRNA表达水平的报道，均为下调的piRNA[9,10]。本研究着重关注上调的piRNA。芯片结果提示，上调2倍以上的piRNA有1532种。鉴于qPCR验证实验不可能全部检测，我们以各标本的原始光密度值≥100且实验组与对照组差异≥10倍为筛选条件，筛选出10个piRNA进行后续验证实验。经RT-qPCR预实验，或因熔解曲线提示非特异扩增，或含量低以致CT值≥35，或实验组与对照组间无表达差异，从10个piRNA中最终筛选出piR-32678进行qPCR验证。qPCR结果显示，与正常对照相比，piR-32678在少精子症和NOA患者精浆中显著升高；而在OA患者精浆中无差异。该结果提示piR-32678可能通过某种途径导致精子发生障碍。piR-32678定位于Y染色体。由于目前piRNA研究处于起步阶段，文献及piRNA数据库均未查阅到piR-32678的靶基因及功能，因此其具体作用机制有待后续进一步研究。由于NOA样本收集困难，例数较少，故本研究应用ROC曲线仅对少精子症的诊断价值进行评估。研究发现piR-32678对少精子症诊断的准确性高（AUCROC=0.950），诊断的特异度为80.77%，敏感度高100.00%。提示精浆piR-32678有望成为男性不育评估的无创分子标记物，并为男性不育症的病因研究提供新的思路和基础。本研究例数较少，后续有待进一步扩大样本量验证及对NOA进行ROC分析。

U6在不同组织细胞中表达较一致，被广泛用作组织细胞中miRNA RT-qPCR相对定量的内参。不少精浆miRNA RT-qPCR研究也以U6为内参[11，12]。但已有研究证实，血浆等体液样本不宜选择U6作为miRNA相对定量的内参[13,14]。我们预实验结果亦显示U6在不同的精浆样本间差异大。这可能是因为体液中的miRNA或piRNA大多存在于微囊结构中或与蛋白质等构成复合物存在，因而能良好地抗RNA酶降解，浓度不受长期保存的影响；而U6为核小RNA，短期保存后不稳定[15]。目前，倾向使用表达稳定的循环miRNA作为体液样本的内参，但主要是在血清/血浆样本中应用较为成熟。不同的体液样本有各自的特殊性，暂无统一的内参适用于所有循环miRNA的RT-qPCR。本研究预实验时参考文献曾报道精浆样本的内参，先后选择5S rRNA、RNU1A1、miR-16-5p、miR-103a-5p、miR484、miR-92a-3p、let-7g-5p、let-7i-5p、miR-30e-3p和miR-30d-5p共10种[14,16]。预实验结果显示，仅5SrRNA在所有精浆样本中均有扩增，但标本间差异大。因此，本研究最终参照Hong等研究及所选用的RNA提取试剂盒说明书[9]，采用在RNA提取过程中加入一定量的人工合成秀丽隐杆线虫的cel-miR-39作为精浆piRNA相对定量的“内参”。实验结果显示，标本间批间差异小，可有效校正提取效率、反应试剂及仪器操作等带来的误差。

少精子症和NOA患者精浆piR-32678表达水平与精液正常男性间存在显著差异，而OA患者精浆中则无差异。精浆piR-32678有望成为男性不育评估的无创分子标记物，并为男性不育症的病因研究提供新的思路。

参考文献

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